El misterio principal de La Mona Lisa es la identidad de la mujer retratada. Por el nombre sabemos que se trata de Madonna (Mona) Lisa di Antonio Maria Gherardini, esposa del magnate florentino Francesco del Giocondo, que en el año de 1503 le encargó al artista realizar un retrato de su esposa, por lo que también se le conoce como la Gioconda. Sin embargo, se cree que la intención original de retratar a la Madona prevaleció sólo hasta cierto punto de la composición, después Da Vinci pudo haberse propuesto plasmar la imagen de la belleza perfecta en una actitud distendida e informal, muy distinta a la rigidez y el artificio de los retratos del periodo previos a éste. Un elemento clave en este sentido es la posición de sus delicadas manos, completamente relajadas, que le dan un acento de magnificencia. Hay quienes han afirmado que se trata de un autorretrato de Da Vinci, pues existen ciertas semejanzas entre esta mujer y los autorretratos que conocemos.
Una comisión liderada por el italiano Silvano Viceti busca autorización para exhumar los restos de Leonardo que yacen en el Castillo de Amboise, obtener material genético y reconstruir su figura para compararla con la obra.
